一、全自动PCR仪操作前准备
试剂与耗材准备
试剂：包括DNA模板、特异性引物(正向和反向)、dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸)、耐高温DNA聚合酶(如Taq酶)、缓冲液及Mg²⁺离子溶液。所有试剂需完全融化后混合，避免浓度误差。
耗材：使用一次性无菌PCR管或96孔板，确保密封性良好，防止交叉污染。
分区操作：在试剂准备区(超净工作台或生物安全柜)完成体系配制，操作时佩戴手套并避免说话，减少气溶胶污染。
仪器检查
确认PCR仪放置在水平坚固平台上，电源电压匹配且接地良好。
检查样品槽是否清洁，避免残留物影响温度传导。
定期用肥皂水清洗样品槽，禁止使用强碱、高浓度酒精或有机溶剂。
二、反应体系配制
混合试剂
按比例将DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液及Mg²⁺溶液加入无菌离心管中，加入适量双蒸水定容至最终体积(推荐15-50μL)。
关键参数：
DNA模板质量：避免降解或抑制剂污染，否则影响扩增效率。
引物设计：确保特异性，避免二聚体或自互补结构，退火温度需与引物Tm值匹配。
Mg²⁺浓度：过高或过低均会抑制酶活性，需根据试剂说明书调整。
分装体系
将混合液快速分装至PCR管中，盖紧管盖或覆盖专用膜，短暂离心(1000-2000rpm，1分钟)使液体沉至管底。
三、PCR仪程序设置
温度程序参数
初始变性：94-98℃，20-30秒，使DNA双链完全分离。
循环变性：94-98℃，20-30秒，维持单链状态。
退火：50-65℃，20-40秒，引物与模板特异性结合(退火温度需通过梯度PCR优化)。
延伸：72℃，1分钟/kb DNA片段，Taq酶合成新链。
循环数：20-40次，根据目标片段丰度调整。
最终延伸：72℃，5-10分钟，确保所有片段延伸完全。
保存温度：16℃，2分钟(避免压缩机过度耗损，禁止设置为4℃无限期保存)。
高级功能设置
温度梯度：在退火步骤设置温度梯度(如50-65℃)，同时测试多个退火温度，优化实验条件。
升温速率(Ramp Rate)：调整升温/降温速度(如3℃/s)，缩短反应时间。
循环增量(Increment)：每个循环后温度或时间递增(如每循环升温0.1℃)，适用于Touchdown PCR等特殊实验。
程序保存与运行
输入程序名称后保存，将PCR管放入样品槽，关闭热盖并旋紧。
启动程序，运行过程中可通过屏幕实时监控温度和时间，支持暂停、跳过步骤或终止程序。
四、实验后处理
产物分析
反应结束后立即取出PCR管，通过琼脂糖凝胶电泳或荧光检测(如SYBR Green)分析产物大小和浓度。
若使用荧光标记法，需确保仪器参数(如激发波长、增益值)与试剂匹配，避免背景信号干扰。
仪器维护
关闭仪器前，待加热模块自然冷却至室温，防止热应力损伤。
定期校准温度传感器，确保温度准确性(如使用标准熔点校准剂)。
清洁样品槽和热盖，检查密封圈是否老化，及时更换损耗部件。
五、全自动PCR仪注意事项
污染防控
实验全程遵循“无核酸”原则，使用专用移液器、枪头和工作服，避免交叉污染。
设立阴性对照(无模板)和阳性对照，监控实验体系可靠性。
安全操作
避免在PCR仪运行时打开热盖，防止高温烫伤或样品蒸发。
禁止使用腐蚀性液体清洁仪器，防止损坏电子元件。
故障排查
无扩增产物：检查模板质量、引物设计或程序参数(如退火温度过高)。
非特异性条带：优化退火温度或增加延伸时间，减少二聚体形成。
温度波动：联系工程师校准仪器，确保温度均匀性符合标准(如±0.2℃)。
当前位置：
地址：深圳市南山区桃源街道留仙大道1183号南山云谷创新产业园龙塘阁301-303
邮箱：dingwenjing@ewell.com.cn
传真：