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细胞培养技巧方法

发布时间:2022-02-18      点击次数:364
  细胞复苏
 
  细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”,复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃,使胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
 
  复苏准备
 
  ●打开水浴锅加热至37℃。
 
  ● 超净台上放好离心管(一般15ml的),细胞培养瓶,移液管,紫外灭菌至少20至30分钟,吹风5至10分钟除去臭氧。
 
  ● 37℃预热好要复苏细胞的培养液,也可以不用预热培养液,根据细胞情况选择。
 
  ●向离心管中加约5至10ml培养液,从液氮罐或-80℃中取出冻存细胞,立即将冻存管放入37℃水浴中并轻轻摇动,待融化后(约2min即可)立即将解冻的细胞转移至含培养液的离心管中,800-1000rpm下离心5min,弃上清,加适量完全培养液轻轻吹打重悬细胞后转移至细胞培养瓶中,轻晃使瓶底液体分散均匀,标好细胞名称、代数、复苏日期,显微镜下观察后放入37℃,5%CO2培养箱中。一般贴壁细胞过夜即可贴壁,换液和传代时间根据不同细胞生长情况而定。
 
  细胞复苏注意事项
 
  ☀复苏时动作要快,尽量减少胞内形成冰晶,影响复苏后细胞活率。
 
  ☀ 融化时尽量不要碰到管口,以免容易造成污染。
 
  ☀若一次性需要复苏细胞很多,可以分批水浴解冻,防止传热不佳使得细胞融化时间延长。
 
  ☀若需要同时复苏好几种细胞,提前在离心管和培养瓶上做好标记,或记住自己摆放的位置,不要弄混乱。
 
  细胞传代培养
 
  1. 悬浮细胞传代
 
  待培养液中酚红指示剂变黄,在已紫外灭菌后的超净台上吸出或倒出细胞悬液至离心管中(根据细胞液的量选择15ml或50ml离心管),800-1000rpm下离心5min,弃去营养匮乏的旧培养液,加预热好的完全培养液适量,轻轻吹打重悬细胞后,吸取适量细胞悬液转移至细胞培养瓶中,或直接取适量细胞悬液至新培养瓶中,再补加一定量新鲜完全培养液进行传代,有些脆弱的细胞用自然沉降法沉降细胞,吸去上面旧培养液加入新的完全培养液后吹散进行传代。传代接种的细胞密度根据不同细胞生长情况而定,一般间隔1-2天即可传代一次。
 
  2. 贴壁细胞传代
 
  待培养瓶底中细胞覆盖率达70%-80%时,在经紫外灭菌后的超净台上,弃去旧细胞培养液,用无菌1*PBS洗涤瓶底细胞1-2次,用1ml(T25培养瓶)或2ml(T75培养瓶)trypsin溶液37℃下作用细胞,待显微镜下细胞回缩变圆,少部分细胞出现流沙状时,快速吸去trypsin溶液,加预热好的新鲜完全培养液终止消化,轻轻吹打使细胞脱落且分散均匀,直接吸取适量细胞悬液转移至新培养瓶中,或800-1000rpm下离心去上清,加适量新鲜完全培养液吹打重悬细胞,然后转移适量细胞悬液至新培养瓶中,再加入一定量完全培养液,摇匀瓶底细胞液后进行培养。
 
  细胞传代培养注意事项
 
  ☀ 吹打时每次不要排完移液管中液体,同时控制吹打节奏,这样不容易吹出泡沫,泡沫对细胞有损伤作用,而且很难再显微镜下观察清楚有没有完全吧细胞吹打下来。
 
  ☀不要等到贴壁细胞完全铺满瓶底,要留有一定空隙时细胞状态才良好。
 
  ☀消化时最好不要等到细胞成片飘起,否则细胞状态受影响且第二天培养中死细胞较多。
 
  细胞冻存
 
  冻存的细胞要处在指数生长期。悬浮细胞和贴壁细胞经离心后用冻存液重悬,计数,冻存的细胞密度一般3*106-1*107 cells/ml,最好不少于1*106 cells/ml,否则复苏后难以养起来,将重悬计数后的细胞悬液以1-1.5ml快速分装至各冻存管中,迅速拧紧盖子,放入梯度冻存盒然后置于-80℃过夜,也可以先4℃放置30分钟,再-20℃放置1-2小时,最后-80℃过夜(16-18小时),若梯度冻存盒不够或无冻存盒,可以将冻存管置于泡沫盒中,用棉花包起来,棉花厚度约1cm,置于-80℃过夜,第二天取出-80℃细胞存放至液氮罐中,并在记录好存放位置信息。
 
  冻存准备
 
  ●配制好冻存液。一般冻存液为培养液,血清,DMSO按照7:2:1的比例配制,也可以血清和DMSO按照9:1配制,不管哪种冻存液配制,血清多多益善,但DMSO都不可以多,以免对细胞造成损伤。
 
  ●准备好冻存管,标上细胞名称,代次,冻存批号,冻存日期。
 
  ●准备好细胞程序降温盒或冻存用的材料,程序降温盒放置室温后使用。
 
  细胞冻存注意事项
 
  ☀程序降温盒有无需有毒异丙醇填充的,有利于实验人员身体健康。
 
  ☀DMSO有毒且皮肤会吸收,做好防护措施。DMSO本身不长菌,不需要做灭菌处理。
 
  ☀由-80℃转至液氮时迅速,避免温度上升影响细胞活性。
 
  ☀每个冻存管不要加入体积太多,以免冻存时凝固体积膨胀,撑开冻存管,且在下次复苏时,融化较慢,导致复苏后细胞存活率不高。
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